• 复苏1-2×10⁷T细胞，接种于100mm培养皿（8 mL培养基/皿，可添加Benzonase核酸酶降解游离DNA）；

• 洗涤3×10⁷CD3/CD28磁珠（2%HSA的DPBS洗涤2次），加入复苏的T细胞中进行激活。

• 离心收集细胞（300g, 5min），重悬至1-2×10⁶ cells/mL；

• 加入CAR慢病毒，MOI=20（可辅加终浓度为8μg/mL的Polybrene 提高转染效率），六孔板离心转染（1000g, 2 h）。

• 离心收集细胞（300g, 5 min），重悬调整密度至1×10⁶ cells/mL，继续培养48小时。

• 细胞计数并取 1×10⁶ CAR - T细胞流式检测转导效率（Protein L-FITC染色），其余细胞补液继续培养（调节细胞密度至5-10×10⁵ cells/mL）。

• 细胞计数，并调节细胞密度至5-10×10⁵ cells/mL。培养体积50毫升，可转移入INNOVESSEL™ 进行扩增培养。

• 细胞计数，补充培养基使细胞密度维持在5 - 10×10⁵ cells/mL，继续培养细胞。

• 重复细胞计数及补液操作。若细胞培养基体积超过180 - 200毫升，可在细胞密度小于2×10⁶ cells/mL时每两天进行一次完全换液，以后需每天进行完全换液直至细胞收获（具体收获时间请按照用户自己计划进行）。

我们按此操作方式，用来自三个Donor的T细胞进行了两次CAR - T制备实验：
细胞转导效率在30%至40%之间；
CAR - T 细胞在lINNOVESSEL™培养瓶中扩增迅速并可进行高密度培养。
lINNOVESSEL™培养瓶中扩增的CAR - T细胞体外药效同传统培养瓶相同。

图 2：不同 Donor 来源的 CD19 CAR - T 细胞转导效率

三个不同 Donor（1/2/3）来源的T细胞经48小时激活后，以MOI=20转导CD19CAR慢病毒转导制备CAR-T细胞。转导后48小时用Protein L标记CAR分子后流式细胞仪检测转导效率。转导效率如图所示（图2a、2b、2c分别对应Donor-1、Donor-2、Donor-3）。

图3：INNOVESSEL™中CAR - T细胞的扩增

由三个不同Donor来源的T细胞所制备的CAR - T细胞在INNOVESSEL™中扩增良好，总细胞数目及细胞活率检测结果如图所示：细胞数目可在10天内扩增至起始数目200倍左右并且始终维持高活率。

图4：用INNOVESSEL™ 和传统Flask培养瓶分别扩增出的CAR - T细胞体外药效相同

CD19 CAR-T细胞经INNOVESSEL™和传统T75 Flask 培养瓶扩增后，同时取样检测细胞因子释放及体外杀伤效果。实验所用CD19阴性细胞系为Jurkat细胞，阳性细胞系是Raji细胞。INNOVESSEL™培养瓶中扩增的CAR-T细胞显示正常的体外药效。

在标准的10天制备过程中，CAR-T细胞可扩增约200倍，且收获时细胞仍处于对数生长期，活率持续维持在>90%。

INNOVESSEL™培养瓶的高透气性设计使其能够支持超高密度培养（接近1×10⁷ cells/mL）。以1×10⁷ 个起始T细胞 在200mL培养体积 中扩增为例，单个INNOVESSEL™可收获总细胞数约2×10⁹。

CAR阳性细胞产量估算：

转导效率：30%-40%

单个培养瓶CAR+细胞产量：6-8×10⁸

注：本文件仅供参考，请针对自己的特定应用进行优化

您在使用INNOVESSEL™ 培养瓶过程中，如有任何建议和意见均可联系我们，您可以通过网站或者微信同我们取得联系